实验二　抗真菌放线菌的分离

一、实验目的

（1）了解采集土样的要求和方法。

（2）掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。

（3）掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。

（4）掌握拮抗菌的筛选方法。

二、实验原理

植物病原真菌引起的植物病害是植物的第一大病害，每年给粮食生产造成巨大的损失。化学农药在植物病害防治上发挥了作用，但其残留与污染环境等问题直接危害了人类的健康及生存。随着绿色农业和有机果蔬的兴起，寻找新的环境友好型病害防治措施开始受到人们的广泛关注。

生物间的相互关系复杂且多样。其中的拮抗关系是微生物病害的生物防治基础。拮抗又称抗生，是指由某种生物所产生的特定代谢产物可抑制他种生物的生长发育甚至杀死它们的一种相互关系。由拮抗性微生物产生的抑制或杀死他种生物的抗生素，是典型并且与人类关系均密切的拮抗作用。在众多的拮抗性微生物产生的抗生素中，有一部分属于农用抗生素，它们具有高效、安全、廉价和可降解等优点，是农药发展的重要方向。井冈霉素、阿维菌素、春日霉素、庆丰霉素和灭瘟素等已在农作物和森林病虫害防治中发挥了较好的作用。

放线菌是一类具有高（G+C）mol%含量的革兰氏阳性细菌，广泛分布在土壤、海洋、动植物体等多种生境，相较于其他微生物它能够产生更为丰富的生物活性物质。据统计，从放线菌发现的生物活性物质已经超过13700余种，占已发现天然活性物质（33500种）的40%以上；目前临床和农业上使用的150多种抗生素，2/3来自放线菌。因此，筛选新放线菌是发现新药的重要途径。放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其他放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。

从土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法。初步分离出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的拮抗菌。首先应根据筛选目的确定实验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈（图2-1）。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。

三、实验材料

黄瓜枯萎病菌、培养皿、三角瓶、吸管、滤纸片直径1cm、土样，镊子，无菌玻璃平盘，无菌玻棒，玻璃刮铲。

高氏1号培养基（用于分离放线菌）：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，pH7.4～7.6。

配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到100mL，调pH，121℃灭菌20min。

四、实验步骤

1.采集土样

铲去表层土，用取样器取规定深度（5～20cm）的土样，装入无菌封口塑料袋中，再装入防水纸袋中，注明采集时间、地点、周边植被及土质特点等，带回实验室自然风干后分离。

2.制备土壤稀释液

称取10g研磨好的土样至250mL三角烧瓶中，加入90mL无菌水和适量玻璃珠，振荡15min，充分混匀，做成10-1倍悬浊液，经梯度稀释后备用。

3.涂布

将事先配置并经灭菌处理的高氏1号培养基加热溶化，于超净工作台内倒平板。倒平板前在培养基中添加适量K2Cr2O7（50～100μg/mL）以抑制真菌及细菌的生长。倒平板的方法：右手持盛有培养基的试管或三角瓶置酒精灯火焰上方5～10cm处，用左手将棉塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰。左手拿培养皿，利用拇指和中指将皿盖在火焰上方5～10cm处打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部。然后平置于超净工作台内，待冷凝后即为平板。

用无菌移液管分别选取合适的土壤稀释液0.1mL加入平板中，右手拿无菌玻璃涂棒，将稀释液沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀。加盖后将培养皿沿一个方向旋转一定角度，重复涂布动作。如此反复几次。平板内边缘处可用玻璃涂棒改变方向再涂布几次。涂布后，需静置30min，使菌液吸附进培养基。在每个平板底部用记号笔做好标记以便区分。

4.放线菌分离

将高氏1号培养基平板倒置于28℃恒温培养箱中培养7～21d。根据放线菌菌落形态差异，将培养后长出的单个放线菌菌落分别挑取少许细胞接种到高氏1号培养基的斜面上，并进行编号。待斜面上长出菌苔后，镜检确定是否为单一微生物。若发现有杂菌，需采用平板划线法进行菌株纯化分离，直到获得纯培养。平板划线方法：在近火焰处，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取待纯化的单菌落一环，先在平板培养基的一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环于火焰上灼烧灭菌，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，如此重复2～3次。将样品在平板上进行稀释，盖上培养皿盖，倒置培养。挑取单个菌落进行纯种鉴定。

5.抑菌活性筛选

将实验室保存的植物病原真菌（黄瓜枯萎病病菌）接种至PDA培养基平板上，倒置于30℃恒温培养箱中培养3～5d。用灭过菌的打孔器，制成直径为5mm的菌饼备用。采用平板对峙生长法对分离纯化后的放线菌菌株进行拮抗性筛选。在PDA培养基平板中央放置黄瓜枯萎病菌饼，同时在与菌饼相距25mm的4个角处分别点接4个分离纯化后待测的细菌菌株，对照平板只接病原真菌菌饼，不点接筛选菌。将做好的平板置于28℃培养箱中培养3～5d，观察待测菌株对油菜菌核病菌有无拮抗作用，选出对病原真菌生长有抑制作用的菌株进行进一步研究。

五、结果与讨论

（1）一共获得了几株拮抗真菌，占总放线菌数的比例大约为多少？

（2）分离放线菌过程中除了K2Cr2O7，还有那些常用的抑制剂。