第一部分　基础实验

实验一　耐盐解磷菌的分离、鉴定及特性分析

一、实验目的

（1）学习并掌握采用透明圈法分离解磷菌。

（2）了解解磷菌溶磷水平的测定方法。

二、实验原理

磷是植物体内有机化合物的重要组成成分，是植物生长所必需的含量仅次于氮的元素，然而由于土壤的固定作用，施入的化学磷肥大部分都与土壤中的Fe3+、Ca2+、Al3+结合形成难溶性的磷酸盐，导致土壤有效磷的缺乏，使磷成为制约作物生产的主要限制因素。为了满足作物的生长，人们往往会通过施加大量磷肥来提高作物产量，这导致磷酸盐迅速在土壤中积累，不仅造成磷素资源的浪费，而且对水体环境安全构成一定的威胁。因此，提高土壤中难溶性磷的利用效率对于农业生态系统的健康发展具有重要意义。研究表明土壤中存在着大量的溶磷微生物，溶磷微生物能够将土壤中难溶性的磷酸盐转化为易于被植物吸收利用的水溶性磷，提高了土壤的供磷水平，从而增加作物产量。另外，溶磷微生物还能分泌生长调节物质，促进农作物植物根系对锌、铜等其他营养元素的吸收，增强植物抗病能力，并减少环境污染。

解磷微生物的溶磷机理主要有：有机酸的分泌、质子的释放、CO2作用、H2S作用和产生磷酸酶。其中产生低分子量有机酸是溶磷微生物具有显著溶解难溶磷作用的主要机理，难溶性磷酸盐能够在酸性条件下溶解；另外，有机酸能与Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+等金属离子发生络合作用，从而将与之结合的磷酸根释放出来。因此，溶磷微生物的溶磷能力往往与培养液的pH存在一定的负相关性。

黄河三角洲是我国最大的三角洲，地域辽阔，自然资源丰富，然而，近年来黄河断流影响了黄河三角洲地区淡水水源的补给，破坏了土壤中水盐的平衡，致使土壤含盐量上升，土壤盐碱化现象严重，盐碱地面积已达4.43×105hm2，占全区耕地总面积的52.5%。盐碱化土壤由于其特殊的理化性质可能会导致传统的非土著解磷菌定殖能力差、竞争力较弱、溶磷能力退化快、菌种淘汰率高等劣势，因此，筛选土著耐盐解磷菌对于开发微生物肥料、提高盐碱土壤磷素利用率具有重要意义。解磷菌在无机磷培养基上形成的透明圈如图1-1所示。

三、实验材料

1.土壤

本实验所用土壤样品取自滨州市沾化县冬枣园枣树根系周围，土壤类型属轻度盐碱土，采集深度为5～20cm。

2.培养基

①改良蒙金娜无机磷培养基：葡萄糖10g，（NH4）2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，Ca3（PO4）2 10g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5。

②牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

③PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。

3.主要试剂和仪器

①试剂：磷酸二氢钾、钼酸铵、酒石酸锑钾、抗坏血酸、浓硫酸、Ca3（PO4）2均为分析纯。

②仪器：高速低温离心机（Beckman Coulter的Allegra X-22R），分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司的TU-1810系列），细菌DNA提取试剂盒和真菌DNA提取试剂盒（北京三博远志生物技术有限公司），引物27F和引物1492R（北京三博远志生物技术有限公司），PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司），PCR 仪（美国ABI公司2720型PCR扩增仪Applied Biosystems 2720 Thermal cycler）。

四、实验步骤

1.解磷微生物的初筛及纯化

称取10g土壤样品置于90mL无菌水中，高速振荡制成土壤悬液，土壤悬液梯度稀释后涂布在改良蒙金娜无机磷固体培养基上，涂好的平板用封口膜封口倒置于生化培养箱中30℃培养7d左右。通过观察平板上所长菌落产生的透明圈（测量其透明圈直径D、菌落直径d，D/d>1.4）来初步筛选解磷菌。挑取具有较明显透明圈的单菌落纯化多次，直至通过平板和镜检观察确定其为纯培养物后，挑取细菌单菌落转至牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养24h左右，分离得到的菌株均置于4℃冰箱保存。

2.解磷微生物的复筛

挑取各初筛细菌菌株的单菌落，放于牛肉膏蛋白胨液体培养基中30℃振荡培养至发酵液变浑浊后离心，用无菌水重悬，即制备成菌悬液（菌数约为1×109CFU/mL）。按5%的接种量将菌悬液接入100mL蒙金娜无机磷液体培养基中，30℃摇床培养7d。培养完毕，发酵液10000r/min离心5min，采用钼蓝比色法定量测定上清液中可溶性磷的含量（使用光程为10mm的比色皿，波长采用700nm），以不接菌作为空白对照。对比各菌株发酵液中溶磷量的大小，筛选出高效解磷菌。

3.高效解磷菌的耐盐性实验

细菌的耐盐性实验选用牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养基中加入不同含量的NaCl：0.5%（牛肉膏蛋白胨液体培养基中固有的NaCl含量）、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%；30℃振荡培养24h后，各发酵液适当稀释后在600nm波长下测定其吸光度Abs，比较各高效解磷菌株的耐盐情况，从中筛选出耐盐性较好的高效解磷菌。

真菌的耐盐性实验采用PDA固体培养基作为基本培养基，培养基中加入不同含量的NaCl：0、2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%；用灭过菌的打孔器在长满真菌菌丝的PDA平板上打孔，然后用镊子夹取琼脂片倒扣在耐盐实验用培养基平板的中心位置（菌丝面贴在新鲜培养基上），30℃恒温培养，分别在第1d、第2d、第3d、第4d、第5d观察并记录菌丝在不同NaCl含量的PDA平板上的蔓延情况。

4.菌落形态的观察

将筛选出的耐盐高效解磷细菌菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上单菌落划线，观察其生长情况及菌落特征，包括菌落颜色、润泽与否、菌落形状、菌落隆起还是平整、边缘是否圆整、表面光滑与否、是否透明、是否容易挑起等。

真菌接种到PDA培养基上，观察菌落的形成及蔓延状况。

5.生长曲线的绘制

将耐盐高效解磷菌株接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中制备其菌悬液，按5%的接菌量接入新鲜牛肉膏蛋白胨培养液中，混匀后，分装到灭菌的试管中，每支试管装5mL，用灭过菌的棉塞封口；分别在0、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、23h、26h、30h、38h取样，每次取三支试管，放于4℃冰箱中，最后一起在600nm下测定发酵液适当稀释后的光密度值Abs。

6.水溶性磷、pH和菌体生长量的测定

将菌株的菌悬液按1%的量接入改良蒙金娜液体培养基，30℃，150r/min恒温振荡培养。每隔24h在无菌操作下从培养液中吸取5mL培养液，取2mL菌液低速（1500r/min）离心3min，然后用等体积1mol/L HCl稀释，以去除上清液中残留的磷酸钙颗粒，600nm波长下测定细菌悬液的吸光度值Abs；将剩余的3mL菌液再经10000r/min离心10min，取上清液用钼蓝比色法测定水溶性磷含量，并测定其pH值。

7.耐盐高效解磷菌的分子生物学鉴定

利用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养细菌，离心后弃上清。菌株采用细菌总DNA提取试剂提取基因组DNA。利用16S rDNA的PCR反应通用引物（上游引物为27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物为1492R：5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。PCR扩增条件为：先94℃预变性5min；再94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后再72℃终延伸10min。PCR纯化产物送北京三博远志生物技术公司利用引物27F和1492R进行双向测序。两引物测出的序列利用Contig1进行拼接。拼接后的序列信息输入NCBI 数据库进行BLAST分析，获得同源性数值，运用ClustalX软件进行分析，形成一个多重复匹配列阵，利用MEGA4.1中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

利用PDA固体培养基培养真菌，刮取平皿表面的菌丝体放入研钵中用液氮研磨。研磨好的菌丝体采用真菌总DNA 提取试剂盒提取其基因组DNA。利用真菌ITS序列的PCR通用引物（上游引物为ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；下游引物为ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增。反应体系与扩增条件同细菌。测序后对解磷真菌进行同源性分析。

五、结果与讨论

（1）分离得到的解磷菌解磷性及耐盐性如何？

（2）如何验证分离菌株在盐碱土壤中的实际溶磷能力？