二、组织学与胚胎学常用技术与方法

（一）光学显微镜技术

随着科学技术的发展，组织学与胚胎学的研究方法也在不断改进，但将组织、器官制成切片，应用光学显微镜观察仍是最基本的研究方法。

光学显微镜（light microscope）简称光镜，是古老而常用的观测工具（图1-1）。最好的光镜分辨率约0.2µm，放大倍数约为1500倍。借助光镜观察到的组织细胞结构，称光镜结构。除普通光学显微镜外，还有用于观察活细胞的相差显微镜，以及用于观察组织细胞内荧光物质或荧光标记物的荧光显微镜等。

组织切片制作最常用的是石蜡切片法（paraffin sectioning），其基本程序为：①取材、固定：取动物或人体新鲜组织切成小块，用固定剂（常用甲醛）固定，使蛋白质等迅速凝固，防止细胞自溶和组织腐败，最大程度保存组织的生前结构；②脱水、包埋：用乙醇脱去组织块中的水分，再用能溶于石蜡的二甲苯置换出组织中的乙醇，然后将组织块置于融化的石蜡中包埋，冷却后便形成了具有一定硬度的蜡块；③切片、染色：将蜡块固定在切片机上，切成5～10µm的薄片，将组织切片贴于载玻片上，经二甲苯脱蜡后染色；④封片：用树胶密封，加盖玻片保存。

组织切片染色的目的是使组织内的不同结构呈现不同的颜色而便于观察。石蜡切片最常用的是苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining），简称HE染色法。苏木精为碱性染料，可将细胞核中的染色质及细胞质中的核糖体染成紫蓝色；伊红为酸性染料，可将细胞质及细胞外基质染成粉红色。组织中凡与苏木精亲和力强而被染成紫蓝色的特性，称嗜碱性（basophilia）；与伊红亲和力强而被染成粉红色的特性，称嗜酸性（acidophilia）；对两种染料亲和力均不强的称中性（neutrophilia）（图1-2）。

组织的染色方法还有许多种，如用硝酸银处理组织或细胞后呈黑色，呈亲银性（argentaffin）；若用硝酸银处理后，还需加还原剂才能显色，称嗜银性（argyrophilia）；用碱性染料甲苯胺蓝将肥大细胞内的分泌颗粒染成紫红色，后者所呈现出的颜色与染料颜色不同的特性，称异染性（metachromasia）；以及用醛复红将弹性纤维染成紫红色等，上述染色方法统称特殊染色（图 1-2）。

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ER-1-1　如何显示肥大细胞

除石蜡切片外，根据组织特性及应用目的不同，还有其他一些制片方法：①冰冻切片：将组织块置入液氮（−196℃）冷冻后直接切片，其程序简单，快速，常用于免疫组织化学的研究和快速病理诊断；②涂片：将液态的组织标本（如血液和精液等）直接涂于载玻片上，以观察游离细胞的形态；③铺片：把柔软疏松的组织（如疏松结缔组织等）撕成薄膜铺在载玻片上，以观察其中纤维的完整形态；④磨片：把坚硬的组织（如骨和牙等）磨成薄片，以便于显微镜下观察（见图1-2）。

（二）电子显微镜技术

电子显微镜（electron microscope）简称电镜，是以电子发射器（电子枪）发射的电子束代替可见光，以磁场代替玻璃透镜，将放大的物像投射到荧光屏上进行观察。电子显微镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万至几百万倍。借助电镜能观察到更微细的结构，称超微结构（ultrastructure）。目前常用的是透射电镜和扫描电镜。

1.透射电镜（transmission electron microscope，TEM）

用于观察组织和细胞内部的结构。由于电子束穿透能力低，所以必须制备超薄切片（厚度通常为50～70nm）。超薄切片的制备过程与石蜡切片相似，也经过取材、固定、包埋、切片和染色等步骤，但固定剂（戊二醛和锇酸）、包埋剂（环氧树脂）、切片机（超薄切片机）及染料（重金属盐）等有所不同。细胞被重金属盐染色的部位，图像深，称电子致密（electron dense）；反之，图像浅，称电子透明（electron lucent）（图1-3）。

2.扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）

用于观察组织和细胞表面的立体结构。扫描电镜标本不需要制成超薄切片，标本经固定、脱水、干燥和喷镀金属后即可观察。由于它的景深长，凹凸不平的表面也能清晰成像，故图像极富立体感（图1-4）。

（三）组织化学技术

组织化学（histochemistry）是应用化学、物理及免疫学的原理和技术，定性或定位地显示组织和细胞内某种化学物质的存在、分布和状态。

1.一般组织化学技术

在组织切片上滴加某种试剂，使其与组织和细胞内待检物质发生化学反应，并形成有色沉淀物，以便在显微镜下识别。如常用过碘酸希夫反应（periodic acid Schiff reaction，PAS反应）显示多糖或糖蛋白的糖链，后者经与过碘酸及希夫试剂反应，形成紫红色产物，以证明多糖或糖蛋白的存在（图1-5）。

2.免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）

根据抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织和细胞中某种多肽及蛋白质等大分子物质的存在与分布。如用已知抗体结合某种标记物形成标记抗体，后者与组织切片孵育时，抗体与细胞中相应的抗原发生特异性结合，在显微镜下通过观察标记物而获知该抗原的分布情况（ER-1-2）。常用标记物有荧光素、辣根过氧化物酶及胶体金等。用荧光素标记抗体，并在荧光显微镜下观察，称免疫荧光技术（immunofluorescence technique）。

ER-1-2　免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）光镜像

培养的主动脉壁平滑肌纤维含肌动蛋白，呈棕黄色（邹仲之 图）

3.原位杂交技术（in situ hybridization technique）

用带有标记物的已知碱基顺序的DNA或RNA片段作为核酸探针，与细胞内待检测的核酸片段按碱基配对的原则进行特异性原位结合，在光镜或电镜下观察待测核酸的存在与定位（ER-1-3）。该技术是一种特异性的核酸分子杂交的组织化学技术，敏感性较高，可从分子水平探讨细胞的基因表达及其调节机制。

ER-1-3　原位杂交（地高辛标记）光镜像

大鼠主动脉壁平滑肌纤维表达弹性蛋白mRNA，胞质呈棕黄色（余灵祥图）

（四）组织培养技术

组织培养（tissue culture）是将离体细胞、组织或器官放置在模拟体内生理环境条件的培养液中，在无菌和适当温度（37℃）等条件下于体外培养，使之生存和生长的一种技术方法，用以研究组织细胞的代谢、增殖、分化、形态及功能变化，以及各种理化因素（如药物、毒物和射线等）对活细胞的影响（图1-6）。

（五）激光共聚焦技术

激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，对样品进行断层扫描和成像，并用计算机进行二维或三维的数字图像分析处理；还可进行活细胞的动态观察，并可对样品进行多重荧光标记的观察（图1-7）。