第九章　人类朊病毒病

朊病毒病（prion disease），又称可传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathy，TSE），是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的退行性脑病，潜伏期长，100%病死率，可在同种动物间传播。其感染因子目前认为是一种不含有核酸、具有自我复制能力的感染性蛋白粒子——朊病毒（prion）。典型的神经病理学改变为脑组织中出现海绵状空泡样变性、淀粉样斑块沉积、神经元丢失和胶质细胞增生。自1730年首次报道羊瘙痒病以来，目前已经在人类以及20余种动物中发现有自然发生或感染的TSE，其中包括人类的克雅病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）、致死性家族性失眠症（Fatal Familial insomnia，FFI）、库鲁病（Kuru）、吉斯特曼-施特劳斯综合征（Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome，GSS）以及动物的羊痒病（scrapie）、疯牛病（bovine spongiform encephalopathy，BSE）、骡鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病（chronic wasting disease，CWD）、可传播性貂脑病（transmissible mink encephalopathy，TME）、猫的海绵状脑病（feline spongiform encephalopathy，FSE）等。TSE的传播具有明显的种属屏障，不同的TSE还可呈现出明显的“毒株”差异，在其临床特征、潜伏期、神经病理学变化以及朊病毒的分子特征等方面有所不同。

第一节　病原学特征

一、发现简史与朊病毒学说

（一）发现简史

1954年，Sigurdsson首次认为“慢病毒”为TSE的病原，并提出诊断此类病毒病的主要标准。1957年，Gajdusek和Zigas报道了发生于巴布亚新几内亚东部高原地区，主要影响儿童和成年妇女的Kuru病。1959年，Klatzo发现了Kuru和CJD之间神经病理的相似性。1960年，Chandler成功地将羊瘙痒因子Scrapie传给小鼠。同年，Nevin等使用“亚急性海绵样脑病”一词。1966年Gajdusek等证明Kuru可传给猩猩；1968 年Gibbs等人的实验表明CJD也可以传给猩猩，同时引入了名词“传染性海绵样脑病”。1976年，Gajdusek因其在库鲁病方面的贡献“发现传染病产生和传播的新机制”而获得了当年的诺贝尔生理学或医学奖。

多年以来，各国科学工作者致力于此类疾病的病原或感染性因子的研究，到1975年，已提出了十几种假说。主要有三种，第一种认为它是普通病毒；第二种认为它是类病毒，即只有核酸的感染因子；第三种也是目前最为盛行的观点，认为它是由蛋白质组成的感染因子，即朊病毒学说。朊病毒学说由Prusiner于1982年提出，认为感染因子为一种小的蛋白感染颗粒（pri加后缀-on，代表一个单位），以此将其与病毒和类病毒区分开来。1997年，Prusiner因其“发现朊病毒-传染的一种新的生物学原理”而获得了当年的诺贝尔生理学或医学奖。

（二）朊病毒学说

大量研究显示朊病毒是TSE致病因子的主要组成部分，甚至是唯一的感染因素，其主要的依据概括如下：

1.朊病毒可伴随着感染因子一同被纯化，是纯化物中最丰富，也是唯一的一种大分子物质。

2.朊病毒的浓度和感染滴度成正比，朊病毒的量在感染动物中出现的动态变化同组织中具有的感染性的动态变化相吻合。

3.对朊病毒的水解、变性和选择性修饰可导致感染滴度的降低。

4.经免疫吸附层析纯化的朊病毒同样具有感染性。

5.只有在被感染细胞中才能检测到朊病毒。

6.由朊病毒形成的淀粉样斑块为人和动物朊病毒病特有，正常朊蛋白（prion protein，PrP）基因参与了空斑形成。

7.羊瘙痒病在小鼠体内的潜伏期长短与PrP基因相关，并与PrP的表达水平相关。

8.表达仓鼠PrP基因的转基因小鼠对仓鼠朊病毒敏感，表达人和小鼠杂合PrP基因的转基因小鼠对人的朊病毒敏感，接种的朊病毒的一级结构控制着神经病理变化和朊病毒的合成。

9.人PrP基因102、178、198、200位氨基酸发生点突变与遗传性朊病毒病相关，PrP基因中多个八聚体的插入与遗传性CJD有关。

10.GSS病人第102位发生点突变，用这一突变基因转化小鼠，转基因小鼠在高表达此突变基因的情况下，会自发产生神经退行性病变，其脑组织提取物具有传染性。

11.缺失PrP基因的小鼠接种朊病毒后不发病。

12.表达小鼠和仓鼠嵌合基因的小鼠产生的朊病毒具有新的特性。

但仍有学者对朊病毒学说持怀疑态度，其原因主要包括：①射线照射灭活动力学研究提示小量核酸基因存在的可能性不能排除；②尚无可信的研究显示感染因子的物理形态的确小于病毒；③尚无资料明确地证明纯化的、不含有感染组织核酸成分污染的蛋白质的确就是海绵状脑病的自我复制因子；④一些实验中，具有蛋白酶抗性朊蛋白构型改变的动力学与感染性动力学不相符；⑤Prion学说不能很好地解释海绵状脑病致病因子具有“毒株样”的特点。不同毒株的羊瘙痒因子的特性（如潜伏期、组织病理变化的分布、淀粉样斑块的形成与否）可随着小鼠传代而准确保留，这些特性偶尔出现的变化与寻常病原体出现的基因突变相类似。

二、理化性质

朊病毒为微小的蛋白感染颗粒，未发现有核酸成分。缺乏单元结构是朊病毒与其他病毒在超微结构上的一个重要区别。单个朊病毒体积非常小，其最小感染形式比最小的病毒还小100倍。此因子能够通过平均孔径小至20～100 m的滤器，对热、多数化合物和光化学反应的灭活作用有非常强的抗性，但可被强碱溶液灭活。另外，它能抵抗修饰核酸的灭活方法，抵御对蛋白质的水解、修饰或变性。

三、形态结构

在TSE病人或动物脑组织中聚集着一种具有对蛋白酶消化相对抵抗的异常蛋白，在电镜下呈现出纤维结构，称之为“瘙痒因子相关纤维”（scrapie associated fibril，SAF）。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium-dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）证实其为一种独特的蛋白，分子量在27～30kDa。这种被称之为PrP 27～30的蛋白质为唾液酸糖蛋白，带有碳水化合物、神经氨酸和肌糖。特别是在病程很长的疾病中，这种蛋白质可存在于淀粉样斑块中。即使无斑块形成，利用免疫组化在皮质下和脑室周围可见PrP蛋白在细胞外的聚集，同时在神经元的高尔基小体和内质网也有PrP的沉积。

不同种属的PrP在氨基酸序列和抗原性方面非常相似。它们都来自一种253个氨基酸的前体蛋白，起初被称之为PrP33-35，以后将正常组织的PrP称之为“细胞”PrP（cellular prion protein，PrPC），将瘙痒病或CJD病人脑组织中的PrP称之为PrPSc（scrapie，amyloid-forming isoform of the prion protein）。在同一种属中出现的PrPSc在氨基酸序列方面与其前体蛋白完全一致。为了避免混淆，有些学者倾向于使用蛋白酶抗性PrP（PrP-res）或蛋白酶敏感PrP（PrP-sen）。PrP-sen向PrP-res转换的同时伴随有由α-螺旋结构为主向β-片层结构为主的构象变化。

四、PrPC和PrPSc的细胞生物学特征

人PrP基因位于第20对染色体短臂，有两个外显子，两个外显子间隔约10Kb。外显子Ⅰ很短，约几十个核苷酸，可能与PrP蛋白表达的起始有关。外显子Ⅱ为编码PrP蛋白的开放阅读框架，人及许多哺乳动物的PrP蛋白都是由连续的阅读框架编码合成的。

（一）正常PrP蛋白——PrPC

PrPC为正常的细胞蛋白，在中枢神经系统的脑和脊髓组织的神经元细胞以及胶质细胞中均有表达，在机体其他组织包括外周神经、淋巴组织等也有表达。哺乳动物细胞编码的PrP约为250个氨基酸左右，可分为N-端信号肽区、5个脯氨酸-甘氨酸富含的八肽重复序列区、高度保守的疏水中间区和GPI锚相关C-端疏水区。PrPC在粗面内质网合成，经高尔基小体转移到细胞膜表面。在整个的生物合成过程，PrP历经几次修饰、加工，包括信号肽切除、两个糖基化位点的糖基化作用、单一的二硫键形成和添加GPI锚。N-连接糖基化作用起始于粗面内质网，富含甘露糖，对内糖酶H敏感。在进入高尔基体后进一步修饰，使得糖链更为复杂，并可抵抗内糖酶H消化。GPI锚的添加也在粗面内质网中进行。PrP分子上有两个糖基化位点，在人PrP蛋白上分别位于Asn181和Asn197，在哺乳动物细胞中PrP分子具有三种不同形式，即双糖基化型、单糖基化型和无糖基化型。目前的研究提示PrPC和PrPSc的寡糖链和GPI锚无明显差异。

（二）异常PrP蛋白——PrPSc

PrPSc在细胞内分布由于正常与异常PrP蛋白在免疫学上的相似性很难准确地确定。对羊瘙痒因子感染的N2a细胞的免疫荧光检测发现PrPSc分子主要分布在细胞内，如高尔基小体。对N2a细胞和脑组织电镜的观测显示PrPSc分子出现在细胞的内涵体及溶酶小体内，一些PrPSc蛋白也出现在细胞膜表面。这提示PrPSc分子在细胞内分布似乎十分广泛。

对在羊瘙痒因子感染的N2a和HaB细胞，突变PrP基因转染CHO细胞中PrPSc生成动力学的研究显示，蛋白酶抗性PrP的半数最大累积出现在感染数小时后。PrPSc含量在24～48小时内稳定，而PrPC明显降解其半衰期约为4～6小时。在感染细胞中仅有少量的PrPC被转变PrPSc，其余的都被降解。降解过程可能是在内体或溶酶小体中进行。

在细胞培养以及脑组织中的PrPSc分子同样也历经蛋白水解过程，以除去部分N端序列。与PrPC不同，PrPSc蛋白的水解位点明显向N端移动。这一酶解过程在PrPSc形成1小时之内开始，胞内的蛋白酶解区域与蛋白酶K水解区域相同，从而形成PrP 27～30。PrPC的酶解区域在蛋白肽链的“神经毒性区域”或“淀粉样变形成区”，而PrPSc的酶解区域在上述功能区域的N端，从而可完整地保留PrP蛋白细胞毒性区域。此外许多GSS病人组织中的PrPSc分子通常很小，在淀粉样斑块中常常可见到7～8kDa和11kDa的条带，这提示GSS相关突变的PrP分子的代谢途径可能完全不同。还有少量的PrPSc分子显示有C端酶解，酶解部位在GPI连接位点的3个氨基酸。

五、PrPC向PrPSc转变的分子机制

（一）蛋白分子结构及相互作用

现有的资料显示正常的PrPC转变为异常的PrPSc只是发生了构象的改变，而没有共价键的改变，其氨基酸序列没有任何变化，甚至在蛋白翻译后的修饰方面都可能差异不大。构象变化最明显的证据是PrPSc分子β-片层结构含量增加，α-螺旋结构略有降低。PrPC分子大约含有42%的α-螺旋和3%的β-片层结构，而PrPSc分子含有30%的α-螺旋和43%的β-片层结构。

在朊病毒感染过程中，PrPC和PrPSc分子间的相互作用被认为是产生新的PrPSc的关键步骤。PrP基因敲除小鼠由于不能表达PrPC，在朊病毒感染时具有明显的抵抗能力。而在转基因小鼠以及培养细胞中导入PrP基因，表达的PrPC可改变对Prion感染的易感性。这些结果高度提示：朊病毒感染的形成必须依赖动物或细胞内正常PrPC的表达。

体外无细胞PrP构象转变系统为更为精确地研究PrP分子间的相互作用提供了可能。在这一系统中，体外表达的PrPC可以被体内形成的PrPSc转化，从而获得抵抗蛋白酶消化的特性。哺乳动物细胞以及昆虫细胞表达的PrPC都可以被有效地转化为蛋白酶抗性蛋白。

2001年，Saborio等首次报道了通过蛋白错误折叠循环扩增（protein misfolding cycling amplification，PMCA）的方式可在体外生成大量的PrPSc，此方法类似于PCR循环扩增DNA的方式，即以少量的PrPSc作为模板，大量的同种属的PrPC作为底物，按一定比例混合后，通过反复的超声波破碎和恒温孵育，使PrPC 以PrPSc作为模板进行复制，最终产生大量的PrPSc。2005年，Castilla等优化了PMCA技术，并发现这些新生成的PrPSc具有使野生型仓鼠发病的能力。该结果说明在体外条件下，PrPC可以利用同种属的PrPSc为模板，通过PMCA技术在体外生成大量具有感染性的PrPSc。该项研究成为了“朊病毒学说”的最有利证据。

（二）PrPSc形成的模型

关于PrPC向PrPSc转变机制一直是朊病毒研究争论的焦点，曾经出现过许多假说或理论，其中两种模型具有较多的实验依据。第一种模型或假说是“核聚集学说”：组织中PrPC可自发地形成PrPSc分子，这些PrPSc单体相互聚集成核，并使其他PrPC单体转变为PrPSc同时形成更大的聚集物。在这一过程中，PrPSc可能是PrP蛋白在细胞内的一种“正常”形式，只有形成一定固定结构的多聚体，才能使得更多的PrPSc聚集从而形成斑块。这些大的“斑块”进一步裂解成为小的“核”，再次重复蛋白聚集过程，从而获得感染性。

另一种假说是“模板学说”：在朊病毒感染初期少量的PrPC和PrPSc分子可形成寡聚体，这一过程或许有其他“分子伴侣”（X因子等）的参与。其中的PrPSc成分可能起着模板或催化剂的作用，使得PrPC分子或者是已经发生部分转化的PrP*中间分子发生彻底的构象转化。在遗传性TSE中，突变的PrP分子可能更容易形成所谓的“PrPSc核”或“PrP*分子”。

第二节　流行过程

一、传染源

自1730年首次报道羊瘙痒病（Scrapie）以来，目前已经在人类以及20余种动物中发现有自然发生或感染的TSE。主要的人类及动物TSE的名称及首次发现时间见表9-1。

克雅病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）

1920年，德国神经学家Creutzfeldt首次报道了一例有六年渐进性大脑功能障碍病史的22岁妇女。一年以后，另一位德国神经学家Jakob报道了另一个病例，并在1922年首次使用了“Creutzfeldt-Jakob disease”—“克雅病”。目前CJD依据其发病机制的不同分为以下几种类型：

1.散发型CJD

大多数CJD病例呈散发型，无地理上的聚集性，在病人之间无明显传播现象。年发病率为1/100万～2/100万，男女病人的比例与整个人口的性别比例一致，与社会经济状况无关。此类疾病的平均发病年龄为65岁（14～92岁）。一项包括178例CJD病人和333例对照病人的分析，以及随后欧盟对405对病人-对照的分析没有发现明显的证据表明饮食（包括食动物脑）、原先的手术、输血、职业以及动物接触有明显的致病危险。但一些学者认为，即使这些相对样本量较大的分析也缺乏统计学的力度，从而有效地发现那些细微的相关危险因素，目前尚不能完全排除散发型CJD来自环境因素的可能性。

2.家族遗传型CJD

人类PrP基因编码253个氨基酸，它包括4个重复的连续八肽及其前面的相似序列的九肽。到目前为止，与家族遗传型TSE相关的至少有14个点突变和8个不同长度的八肽重复插入。家族遗传型TSE为显性特征遗传，发病约占整个CJD病例的5%～15%，比散发型疾病具有更多的临床病理变化。最常见的疾病相关突变是Pro102Leu和Gln200Lys。而中国汉族人群中以Asp178Asn和Thr188Lys最为多见。

3.医源型CJD

见表9-2。1974年美国报道了一位角膜移植病人在术后18个月后出现CJD症状，而移植物提供者也是经过两个月的共济失调，记忆丢失和肌阵挛后死亡。病理解剖发现受体和供体都有典型的CJD神经病理特征。1977年报道了两位由于患顽固性癫痫的年轻病人进行了皮质脑电描记法而患CJD。所用的电极曾在一位70岁妇女的脑中滞留了2天，而这个妇女患有4个月的情绪紊乱，共济失调，精神恶化和不随意运动。3个月后，她死于经组织学证实的CJD。将此电极插入猩猩的额叶，18个月后该猩猩发展为经组织学证实的CJD脑病。

1987年报道了首例与使用尸体来源的脑硬膜同种移植神经手术相关的CJD。随后确定了68例相似病例，病例来自加拿大、美国、英国、意大利、西班牙、德国、澳大利亚、新西兰、日本和阿根廷。涉及的移植物大多数为1982—1986年德国加工的“Lyodura”商标产品。

1985年报道了首例因使用尸体来源的人生长激素（hGH）患CJD的病人，随后又相继发现了97例病人，主要出现于法国、英国和美国。巴西和新西兰也出现有由于使用美国生产的hGH的病例，澳大利亚也报道了由于使用本地生产hGH的患者，此外还报道了4例接受尸体来源的垂体促性腺激素进行治疗的妇女患CJD的病案。

4.库鲁病（Kuru）

是一种发生于生活在巴布亚新几内亚山区相近村落的高地新几内亚人的TSE。这种疾病在1955年首次报道，但实际病例的发生可能更早（数十年）。“Kuru”在Fore语中的意思是颤抖或发抖，80%的库鲁病发生于Fore人。库鲁病在这类人群的发病率约为1%，通常妇女和儿童的发病较成年男子多见，导致在一些村落男/女人口比例超过3∶1，同时也使人们错误地认为某些性连锁因素在疾病发生上起重要作用。起初库鲁病的病因不明，但随后深入的研究证实疾病的发生起源于当地的食人仪式。这种食人仪式是为了纪念死去的男性亲戚，高度感染的脑组织造成了包括结膜、鼻、皮肤、黏膜和胃肠道等器官组织的污染。由于文化的原因，男人们通常在这种纪念仪式中不接触感染性组织，这可解释库鲁病在男性人群中发病率低。随着50年代末食人风俗的终止，库鲁病的发生逐渐消失，随后的老年组人群极少出现库鲁病。库鲁病的潜伏期可从≤4. 5年到＞35年。在食人风俗取消后出生的孩子，尽管母亲患有库鲁病，却无一发病。这提示母婴的垂直传播极为罕见。

5.吉斯特曼-斯特劳斯综合征（Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome，GSS）

GSS综合征是一种常染色体显性疾患，它表现为渐进性小脑共济失调，特征性地导致神经病理上可见的淀粉样斑块。然而此类疾病的表型在一个单一GSS家族中也有很大的差异，某些受害个体表现为与典型的散发型CJD难以区分的快速渐进肌阵挛性的痴呆。GSS综合征也可简单地用于指遗传疾病的类型，它具有特征性的病理表型，在小脑出现很多多中心PrP阳性淀粉样斑块。

6.致死性家族型失眠症（Fatal Familial Insomnia，FFI）

FFI是1986年从一个意大利家族首次报道的。典型的临床特征为严重的失眠和自主性衰竭，病理上表现为显著的丘脑神经胶质增生，很少或几乎没有海绵样变化。平均发病年龄为49岁（25～61岁），疾病病程为13个月（7～33个月）。睡眠紊乱是大多数病例早期出现的征象。内分泌异常表现为儿茶酚胺和皮质醇升高，正常昼夜节律的消失。随着疾病的发展，出现更为典型的CJD特征，包括共济失调和肌阵挛。

7.变异型CJD（new variant CJD）

1996年在英国和法国出现了20多例独特的累及年轻人的新变异型CJD（vCJD）。以往不被人们认识的vCJD具有特殊的临床和病理特征，所累及的年轻人除了有可能接触潜在污染的BSE因子外没有任何共同的危险因素，它的出现强烈提示vCJD是由BSE因子引起的。进一步的研究显示vCJD与自然发生或实验感染的BSE所出现的异常聚集蛋白具有相同的糖基化类型，接种小鼠后出现相同的神经病理损伤，这为“BSE因子引起vCJD”理论提供更加有力地依据。变异型CJD的特异性传播工具或途径尚不清楚，但污染有牛神经组织的牛肉或牛肉制品的可能性最大。目前仍无法确切预计在英国究竟会出现多少vCJD病人（截至2014年6月，全球共有229例vCJD病人报道，其中英国177例）。

二、传播途径

许多学者曾利用自然或实验感染羊瘙痒病研究海绵状脑病的发病过程。致病因子似乎可穿过表皮而进入机体，而绵羊肠管可能是进入机体的部位。致病因子似乎先在穿入局部的淋巴结中复制，以后在脾脏和其他淋巴器官中复制。对免疫缺陷小鼠和淋巴细胞重建的PrP缺陷转基因小鼠的研究显示，淋巴细胞尤其是B淋巴细胞对致病因子从外周循环到CNS的转移十分重要。致病因子也可沿着外周神经直接进入脊髓部位，而不涉及淋巴组织。皮下接种方式最接近自然感染过程，在这些实验动物中TSE因子总是在后期才在CHS中出现。在经口感染BSE因子的实验牛中，致病因子出现在中枢神经系统、三叉神经和脊神经根、眼睛和远端回肠，在骨髓仅有短暂出现。在CJD病人中TSE因子在其他非神经组织中也曾发现，但对在人类TSE漫长的潜伏期过程中致病因子的分布和含量情况仍了解甚少。

目前，已有三例因输血而感染vCJD的病例报道，献血人群中的潜在感染者成为了最为主要的危险因素，因此，许多国家都禁止曾有过输血史的献血者献血，但是这种预防方法并不是100%有效。由于目前常规检测方法不能从血液中检测出vCJD的感染因子，所以，尽快建立高特异性、高敏感性和稳定性的检测和过滤方法才是主要的预防方向。另外，变异型CJD病人淋巴组织中PrP-res的出现明显多于散发型CJD病人。

库鲁病和CJD不存在母婴传播，患有TME的貂也不能将致病因子传播给其幼仔。实验感染的啮齿类动物也不具羊瘙痒因子宫内传播的现象，但绵羊似乎存在有宫内传播以及分娩时接触传播。牛的垂直传播似乎不是维持英国BSE流行的主要因素，但可疑性不能排除。

人类vCJD的传播途径大多认为是受BSE感染因子污染的食物通过消化道感染的。感染因子先进入肠道局部淋巴组织并在其中增殖，再出现于脾脏、扁桃腺，最后定位于中枢神经系统。

三、人群易感性

（一）宿主PrP基因

家族遗传型CJD的家系分析显示为常染色体显性遗传病，疾病无隔代遗传现象，累及约50%的病人子女，发病无性别差异。GSS也是常染色体显性遗传。家族遗传型CJD和GSS的基因变化为PrP基因序列上的一些突变，目前已证实10余种点突变以及一系列的插入突变与家族型CJD或GSS发病有关（表9-3）。

FFI病人PrP基因具有178位密码子突变（178Asn），这一突变与一些家族型CJD的突变一样。但这两种疾病患者PrP基因在129位氨基酸位点具有不同的多态性（在正常人群中129位密码子可编码甲硫氨酸和缬氨酸），FFI病人为129Met/178Asn，而家族遗传型CJD患者为129Val/178Asn。目前尚不清楚基因上一个密码子相同的突变如何与另一密码子正常的多态性核苷酸作用，引起不同的临床疾病发生。

应当指出并非所有的带有PrP基因点突变的人都会出现疾病，甚至是在具有发病家族史的人。曾有报道在一个CJD家族史的家庭中有两位第200位氨基酸突变的健康八旬老人。FFI家族中一些第178位氨基酸突变的成员也不伴有任何症状地存活超过60岁。仍不清楚这些带有PrP基因突变的未发病成员是否是由于潜伏期太长而处于隐性感染阶段，还是完全无感染。但无论何种原因，在对待未发病的家庭成员时应注意疾病的出现发生具有差异。

（二）人PrP基因第129位密码子的多态性

基因多态性一般是指某等位基因在人群中长期稳定存在，且分布频率在1%以上的形式。人PrP基因第385位核苷酸由A→G的转换使PrP第129位氨基酸由Met（M）变为Val（V），这一现象首先被认为是GSS病人的一种突变，进而Collinge等人对较大样本量的人群PrP基因的分析发现这一突变在高加索人群中广泛分布，因此认为是一种PrP氨基酸多态性位点。对比分析各种人群PrP 129M与129V等位基因分布情况的数据可以发现，129V等位基因分布频率在不同种族间存在差异，在中国汉族人群与日本大和民族人群中，其基因频率接近分别为3%和4%，在高加索人群中，分布频率为38%左右，而在维吾尔族人群中其分布频率为9%左右。

在Berr等对1163例59～71岁的老年群体的调查中显示129V纯合子老年人中有认知障碍的个体比例明显高于129位M/V杂合子人群与129M纯合子人群（P＜0. 003）。这些结果提示129位氨基酸多态性可能对PrP蛋白分子的空间构象形成及其正常生物学活性具有十分重要的影响作用。

1. PrP第129位氨基酸多态性与vCJD

在目前已知的226例vCJD病人中，PrP129位氨基酸无一例外地是Met的纯合子。Prusiner等假设朊病毒在种属间的传播部分地取决于PrP中间氨基酸残基的相似性，其中包括第129位氨基酸，而牛的第129位氨基酸还没有发现非Met形式。体外实验亦证明牛朊病毒转化129M纯合子的人PrPC比转化129V纯合子PrPC更为有效。如果上述的假设正确，129M/V与129V/ V的人群似乎可抵抗牛朊病毒的感染。

2. PrP第129位氨基酸多态性与sCJD

Collinge等研究表明，在sCJD病人中129位氨基酸纯合子比例比正常人群高（89% vs. 49%，P＜0. 001），从而得出结论129为氨基酸纯合子比杂合子更容易患sCJD。Windl等在对67例CJD病人的调查中发现三种基因型对CJD的相对危险度M/M∶V/V∶M/V为11∶4∶1。在临床症状上129M/M表型的病人表现为视觉障碍，人格改变，肌肉痉挛，幻觉出现及脑电图改变。神经病理方面没有淀粉斑形成，病程较短，平均17个月。而在带有129V基因的病人当中，病人开始表现为共济失调和健忘。但并不总是有肌肉痉挛和脑电图改变这样的症状，但无一例外地可检出淀粉斑，同时病程较长，平均为55. 6个月，临床症状与神经病理改变类似于GSS病人。

3. PrP第129位氨基酸多态性与医源型CJD

对23例与人生长激素治疗有关的医源型CJD的研究中发现，所有病例都是129位氨基酸纯合子（129M/M或129V/V），同正常对照组有明显的差异（P＜0. 001）。Collinge等发现在医源型CJD病人中，129V/V表型的病人比例远比正常人群为高。这提示129位纯合子病人可能更易患医源型CJD，而129位氨基酸杂合子的人群，由于存在两种不同构象的PrPC分子，可能阻碍了PrPSc的形成。

4. PrP第129位氨基酸多态性与家族遗传型CJD

Goldforb等于1992年首先报道，在人PrP基因D178N突变中由于同一染色体上第129位氨基酸不同而引起两种不同的遗传性朊病毒病，当178N与129V位于同一染色体上时引起家族型CJD，而当178N与129M位于同一条染色体时则表现为FFI，表明129位氨基酸的多态性决定了同一致病突变的两种不同的表型。CJD通常表现为痴呆、视觉异常、精神失常；而FFI通常表现为失眠和家族型自主神经异常。这一结果说明，129位M或V连同突变的178位Asp可形成两种不同的PrP异构体，并引起截然不同的疾病。进而发现带有D178N突变129位氨基酸纯合子表型的FFI病人表现为自主异常，病理改变局限于丘脑，病程小于一年；而129位氨基酸杂合子表型的病人表现为共济失调和构音障碍，病理改变扩展至整个大脑直至皮质，而病程长于一年。

5.体外转化实验与人PrP基因第129位氨基酸多态性

1997年以来，不同种属间的PrP-sen和PrP-res体外转化实验作为控制分子间作用的一种方法被广泛的应用于朊病毒的研究。在Roymond等人的研究中分别使用牛PrP-res和羊PrP-res转化129Met和129Val的PrP蛋白，结果发现，129M PrP-sen比129V PrP-sen更易被转化为PrP-res，129M PrP-sen的转化率比129V PrP-sen约高2. 5倍，而对人PrP-sen而言，牛PrP-res比羊PrP-res的转化效率更高。

（三）种属屏障现象

朊病毒的种属屏障一般指不同毒株在不同种属动物中引起疾病的难易程度。实验显示，一种朊病毒毒株在另一种动物体内初次传代时，潜伏期长，通常只使个别动物发病，但使用发病动物脑组织在同种动物中持续传代，所有动物都会发病，并且潜伏期大大缩短。这种种属屏障作用可通过使用表达外源性PrP或嵌合PrP的转基因小鼠来消除。

1.实验动物中的种属屏障

野生型小鼠，常抵抗仓鼠朊病毒株的感染，而表达仓鼠PrPC的转基因小鼠（Tg［SHaPrP］）对仓鼠朊病毒株敏感，而且在这种转基因小鼠中，外源性PrP蛋白表达水平越高，接种后潜伏期越短。在这样的小鼠脑中接种仓鼠朊病毒毒株，发病后产生仓鼠朊病毒，而接种小鼠朊病毒毒株，发病后产生小鼠朊病毒，这种结果提示存在PrP分子间相互作用，并与自身朊病毒复制有关，而且这种相互作用在两种分子的一级结构一致时最易发生。仓鼠PrP与小鼠PrP有16个氨基酸不同，在对仓鼠、小鼠和嵌合PrP小鼠（Tg［MH2M］）的研究中发现，仓鼠朊病毒株在经Tg［MH2M］小鼠传代后可感染小鼠，而小鼠朊病毒株经Tg［MH2M］小鼠传代可感染仓鼠，说明种属屏障可被打破。

人类朊病毒很少可以在啮齿类动物中传代成功。人朊病毒病在低水平表达人鼠嵌合PrP的转基因小鼠Tg［MHu2M］中成功进行了传代，这一品系小鼠中鼠PrP第94位至188位氨基酸被替换为人PrP相应序列。人类朊病毒不能传播给高水平表达人PrPC的Tg［HuPrP］小鼠，但可传播于不表达鼠PrP的Tg［HuPrP］PrP0/0小鼠，这一结果提示，鼠PrPC的表达可能抑制了人PrPSc的变构。但BSE可传播于表达人PrPC的转基因小鼠Tg［HuPrP］，说明不同朊病毒毒株的特性在这种种属屏障中也发挥作用。

BSE对非转基因小鼠中并不敏感，表达牛PrP的转基因Tg［BoPrP］小鼠，和表达嵌合鼠牛PrP的转基因小鼠Tg［MBo2M］也相继建立，但与Tg［HuPrP］和Tg［MHuPrP］中的研究不同，Tg［BoPrP］小鼠在脑内接种BSE脑组织提取物后约200天至300天发病，而相反表达嵌合PrP的Tg［MBoPrP］都不发病，Tg［Bo-PrP］小鼠建立为测定BSE中朊病毒的准确滴度提供了有效手段。

2.自然感染中的种属屏障

在自然感染中，TSE也存在着明显的种属屏障现象，大量的流行病学资料显示羊瘙痒病似乎不能传染给人，从事畜牧业养殖、加工的人员、肉制品工作人员以及畜牧业发达地区的CJD发病率与其他职业和地区相比并无差异。对CJD病人脑组织中PrPSc的分布分析也显示与羊瘙痒因子的分布无相同之处。此外，人CJD的发病率在羊瘙痒病发现的270年间无明显改变也说明羊瘙痒病不能传染给人。

TSE自然感染中突破种属屏障的现象也非常多见，最为典型的是疯牛病可自然地传染给人以及包括猫科动物、其他反刍动物。目前大量资料证实人类vCJD与疯牛病的暴发密切相关，主要依据如下：①疯牛病与人vCJD在流行病学上具有高度的时空吻合性。目前已证实的vCJD绝大多数发生于英国，首次报道时间在疯牛病暴发高峰期五年以后。②BSE感染因子和vCJD感染因子（PrP-res）的电泳带型和糖基化比例一致。③实验动物上BSE和vCJD感染因子在发病潜伏期、临床病程、PrP-res蛋白在脑组织中的分布一致。④BSE因子可通过消化道感染非人类灵长类动物。⑤转基因小鼠（人PrP基因）对BSE感染因子敏感。这一种属屏障的突破使得疯牛病从单纯的畜牧业灾害变成严重危害人类卫生健康、食品化妆品、医药产业、各种新兴生物技术产业的世界公害。

第三节　流行特征

人类CJD首次报道于1922年。目前可分为不明原因的散发型（占85%左右）、家族遗传型（5%～15%）、医源型（1%左右）。1996年出现了与疯牛病发病相关的变异型CJD（variant CJD，vCJD）。在发病年龄、临床表现、临床病程及病理学特征等方面与已发现的CJD都有所差异。人类CJD自首次报道以来其发病率一直保持稳定，散发型和家族遗传型CJD的年发病率约1/100万～2/100万，并呈散在分布，无明显的季节性和性别差异，职业分布广泛。CJD具有医源性传播的危险，已经明确CJD可通过神经外科手术、硬脑膜移植、角膜移植、垂体提取物注射、输血和消化道等方式传播。

1996年在英国和法国出现了独特的累及年轻人的vCJD病人。vCJD无论在发病年龄、临床表现及病程等方面都明显不同于传统的CJD，而且流行病学和实验室研究都高度提示vCJD的出现和BSE高度相关。大量的资料也证实疯牛病因子可以通过食用受疯牛病感染因子污染的食物进入人体，在人体局部消化道的淋巴组织中增殖，并最终定位于中枢神经系统。截至2014年6日，全球vCJD病人已经达到229例（表9-4），主要分布在英国和欧洲其他国家，在亚洲的日本、沙特阿拉伯、中国台湾也出现了vCJD病人。最近的资料证明，vCJD可通过输血造成人群之间的传播，已经对人类的公共卫生健康形成了威胁。

第四节　预防控制

一、疾病监测

（一）监测意义及目的

1.意义

由于对TSE感染因子和发病机制有限的认识，对类似的神经退行性疾病缺少有效的治疗，同时发病后的免疫耐受使得特异性预防难以实现，因此对于疯牛病暴发、防止对人类形成灾难性的后果以及在可预见的时期内彻底消灭疯牛病只有依靠有效的监控（包括动物TSE及人CJD的监控）。中国疾病预防控制中心（China CDC）在中华人民共和国卫生部的领导下，自2006年起在全国10个省（市、自治区）开展了人类CJD的监测工作，2008年又扩展到12个省（市、自治区）。

2.目的

（1）监测散发型CJD的发病病例和发病率，了解我国CJD发病的状况。

（2）严密监测在我国是否有变异型CJD（vCJD）病例出现。

（3）对我国CJD病人进行必要的流行病学调查。

（4）对CJD病例进行分型。

（5）建立我国CJD病人脑组织、脑脊液和血液标本库和资料库。

（二）总体监测情况

1.监测点

我国CJD的监测网络从2006年开始正式运转，覆盖北京、上海、天津、重庆、吉林、陕西、湖北、广东、贵州、安徽、河南、新疆等12个省（市、自治区）。每一个监测省设置1～2个哨点医院，在各省级CDC的协调下完成监测工作。

2.监测工作方式

采取3+3+3的病例报告模式：

（1）临床医生在作出疑似或临床CJD病例诊断后3个工作日内报告监测点医院CJD监测负责人和联系人。

（2）监测点医院CJD监测联系人在3个工作日内报告省CDC的CJD监测负责人和联系人。

（3）省CDC在3个工作日内完成流行病学调查后，3个工作日内报告国家CJD监测负责人和联系人。

（4）临床医生采集标本后应在1个工作日内送省CDC，省CDC在3个工作日送往国家CDC的CJD监测实验室（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所）。

（5）国家CDC的CJD监测实验室接到报告后，分析收集的各种数据、进行临床标本检测，一周内向中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室汇报，并反馈各地CDC。

3.主要监测数据

（1）从2006年1月1日至2012年2月29日，CJD监测系统共收到各类上报监测病例832例，根据《克雅病诊断标准》，结合临床表现、流行病学和实验室检测结果，共诊断各类CJD病例372例，未发现变异型克雅病（vCJD）病例，未发现医源性克雅病（iCJD）病例。

（2）诊断的各类CJD病例包括sCJD确定诊断病例3例，临床诊断病例223例，疑似诊断病例112例，遗传型人类朊病毒病34例（包括吉斯特曼斯特劳斯综合征病例2例，致死性家族型失眠症病例15例及遗传型克雅氏病病例17例）。

（3）病例报告无季节聚集性，长久居住地呈散在分布，职业分布广泛。临床诊断病例平均年龄为60岁，男女比例为0. 96∶1；疑似诊断病例平均年龄为57岁，男女比例为1. 27∶1。

（4）快速进行性痴呆为最常见的首发症状，占全部诊断病例的50%。在临床和疑似诊断病例中，出现肌阵挛症状的分别为74. 2%和56. 3%、出现视觉或小脑障碍的分别为57. 1%和58. 3%、出现锥体/锥体外系功能异常的分别为77. 9%和79. 2%、出现无动性缄默症状的分别为38. 0%和30. 0%。临床诊断病例比疑似诊断病例出现更多的典型临床表现。

（5）脑脊液中14-3-3蛋白检测阳性以及出现典型的EEG是sCJD临床诊断的重要指标。在诊断为临床诊断sCJD的病例中14-3-3蛋白阳性和出现典型EEG的比例分别为69. 3%和63. 5%。

二、预防控制原则

由于对TSE感染因子和发病机制有限的认识，对类似的神经退行性疾病缺少有效的治疗，同时发病后的免疫耐受使得特异性预防难以实现，因此对于疯牛病暴发、防止对人类形成灾难性的后果以及在可预见的时期内彻底消灭疯牛病只有依靠有效的监控（包括动物TSE及人CJD的监控）。而有效的TSE监控在很大程度上又依赖更为有效的检测手段的建立。

三、常规处理原则

（一）病人日常处理

可按照克雅病病人护理原则进行护理：

1.无须特殊病区，无须负压病房，但最好使用单间（治疗护理方便）。

2.病人的分泌物及大小便不用特殊消毒处理。

3.病人住院或出院后病房无须进行特殊消毒处理，但滴洒或污染有病人血液或其他组织样品可用20 000μg/g的NaClO或2mol/L NaOH表面覆盖浸泡1～2小时灭活。

（二）医务人员防护

1.尽量避免直接接触CJD病人血液。

2.避免在护理、检查和治疗时的直接贯通伤。

3.一旦出现意外应立即用大量清水冲洗。

4.日常接触病人机体最好戴手套，但无须呼吸道防护。

（三）密切接触者处理

无须进行任何隔离或临床观察。

（四）器械及病人用品处理原则

1.尽量使用一次性器械和用品，接触体表器械无须特殊消毒，接触组织且需重复使用的器械必须特殊消毒。

2.重复使用的非一次性金属器械可经134～136℃高压蒸汽灭活1～2小时，一次性锐器可在2mol/L NaOH浸泡1小时后，放入适当的容器焚烧。

3.病人尽量使用一次性用品，病人死亡后焚烧处理；衣服被褥等如污染有血液应焚烧处理。

第五节　实验室检测、诊断方法及生物安全

一、实验室检测和诊断方法

在排除其他神经系统疾病的前提下，TSE通常通过典型的临床症候群进行诊断。中年病人具有进行性的痴呆和肌阵挛（或者年轻病人具有可能的医源性传播史或存在vCJD的可能）就应怀疑为CJD。疾病后期脑电图常常显示典型的在慢波或无规律波形的基础上出现周期性高电压复合波（周期性放电在vCJD病人中没有发现，仅显示弥漫性的慢波）。脑脊液中14-3-3蛋白明显增高亦提示CJD的发生。近几年，磁共振成像（MRI）因其在发病早期即出现典型的影像改变也逐渐加入到CJD的诊断中。除此之外，血液系统检查和临床生化检测则均无明显异常。目前用于进行CJD诊断的标本、检测内容、检测方法和检测意义见表9-5。

（一）血液标本

主要用于检测PrP基因是否发生疾病相关突变，该检测结果是遗传型人类朊病毒病确诊的主要依据之一。另外，研究表明PrP基因第129位氨基酸多态性与CJD的发生具有明显相关性，通过基因测序也可以确定其易感性。

（二）脑脊液标本

CJD病人CSF细胞和蛋白含量正常。CSF14-3-3蛋白阳性是CJD临床诊断的依据之一，但14-3-3蛋白与PrP蛋白无关，CSF中14-3-3蛋白的检出并非CJD特异，在急性病毒性脑炎和近期脑梗死病人脑脊液中也常可出现。在实际应用上，14-3-3蛋白的检测常用于区分CJD和Alzheimer综合征。CJD病人血液中14-3-3蛋白为阴性。其他CSF蛋白，如tau、S100等的诊断意义仍在评估中。

（三）脑组织标本

TSE的确诊只能通过脑组织检测进行。常规HE染色切片中出现大脑和/或小脑皮质和（或）皮质下灰质中的海绵状变性是CJD确诊指标之一。TSE确诊的另一指标是在脑组织中检测出PrP-res，目前纳入CJD诊断标准的检测手段包括利用PrP蛋白特异性抗体进行的免疫组化和Western blot技术。在进行检测时需要首先破坏消除检测组织中正常的PrPC成分，免疫组化时常用甲酸和高压水解处理切片，Western blot检测时采用蛋白酶K消化。利用电子显微镜在脑组织中检测出典型的SAF也具有诊断意义，但由于视野狭窄同时需要特殊仪器，往往不作为常规技术。

易感动物的脑组织接种可产生典型的海绵状脑病，具有诊断意义，但耗时太长且费用太高。在目前常用的实验动物中，松鼠猴（squirrel monkey）对CJD的易感性最为稳定，但在进行接种前应观测至少3年从而确定实验动物的确为TSE阴性。大多数确诊的散发型CJD病人脑组织接种到啮齿类动物后都不能引起疾病。

二、实验室生物安全

虽然已知TSE病原体是有传染性的，但在通常的意义上，它不是接触传染的。暴露于CJD病人的个体、配偶、护士和医生看来对本病并不具有增高的危险。某些可能被认为在暴露于TSE病原体方面处于“高危险”的专业人员，如病理学家、神经外科医生、屠宰工人等，看来也不是处于患CJD的高危险中。还没有确实证明的CJD病人是经职业性感染的。

实验室工作人员偶尔意外感染TSE因子的可能性十分小，但疾病发病后无一例外地死亡。由于TSE病原体对外界灭活因子的抵抗力强，因此在处理具有潜在感染性组织时应注意。实验证据表明，该病原体对下列措施均有耐受性：煮沸、冷冻、乙醇、过氧化氢（双氧水）、过锰酸盐、碘、氧乙烯蒸气、去垢剂、有机溶剂、甲醛、紫外线、γ射线和标准的高压灭菌。因此所有的实验操作都应在生物安全柜内进行，可用标准方法净化柜子（如福尔马林熏蒸），以灭活其他可能存在的病原体；使用专用的设备，不能和其他实验室共享。必须穿一次性的实验室防护服（罩衫和围裙），使用后应该高压灭菌；必须戴手套（病理学者要在两层橡胶手套之间戴钢网手套），钢网手套使用后收集起来以备消毒处理。尽可能使用一次性的塑料器皿，且这些器皿可视如干燥废弃物一样处理和丢弃。手术器械应经2mol/L NaOH或20 000μg/g的有效氯溶液浸泡1小时后，清水洗净，134℃高压1小时。用内切式匀浆机处理感染性材料，必要时将刀头用消毒剂清洗二次，然后用清水清洗二次。超声波细胞粉碎机消毒方法同上。清洗后的污水一定要倒入终浓度为2mol/L（或浓度更高NaOH）或20 000μg/g的有效氯溶液中。不耐高压的器械使用次氯酸钠（有效氯不能低于20 000μg/g）或2mol/L NaOH溶液浸泡1小时以上，并且需适当再清洗以除去残留的消毒液。在处理感染性材料接种动物时，在工作台面上放置一个不锈钢托盘，托盘上加一层防护物，用完后高压。操作时若出现滴、洒、漏，一定要用纸巾覆盖污染处，再用消毒剂喷洒在覆盖物上，不得少于1小时，然后再清洗表面。不同毒株使用的器械（手术器械和匀浆器等）分开使用，并做好标记，防止交叉污染。

在进行病人组织或体液检测的实验室严格执行国际通用的防护规定可有效降低TSE因子感染的概率。甲酸可促进PrP-res的免疫组化染色和组织切片中淀粉样斑块的染色，同样也可有效地降低TSE因子的感染性。羊瘙痒病和人类TSE各组织的感染能力见表9-6。

随着疯牛病的暴发，对病牛各种器官组织中疯牛病感染因子的感染性进行了广泛的研究。牛对疯牛病感染因子高度敏感，研究显示1g BSE病牛脑组织就可通过消化道感染一头牛。实验中BSE可经0. 5g感染的牛脑通过喂养可传染给绵羊，但目前尚无证据证明在英国的羊中存在有BSE毒株。猪经非肠道接种感染性牛脑匀浆后，表现为对BSE的敏感，但经肠道接种后则不敏感。结合羊瘙痒病感染因子的感染度，WHO将牛组织和体液的可能感染度分为四级，见表9-7。

总之，朊病毒通常对大多数物理和化学因子的灭活有抵抗作用，应重点防范实验室人员吸入污染材料或刺破皮肤，强调尽可能使用一次性器材，生物安全柜的表面要使用保护性遮盖物，用后处理，疑似含有朊病毒的物质在使用和丢弃前需要特殊处理。

（陈操　董小平　编　段广才　审)

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