5.10　红茂草生物碱正交提取工艺模式的建立

5.10.1　材料与方法

（1）材料

①样品

红茂草采自小陇山林区，由王廷璞研究员鉴定，经自然风干、粉碎，过筛。

②仪器及试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪（Agilent公司）、RE52-99型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、UV-751GD型紫外-可见光分光光度计（上海分析仪器厂）、KQ-500D型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、AB104-S型电子分析天平（瑞士梅特勤公司）、索氏提取器等。

异紫堇碱标准品（购自ABCR Gmbh & Co.KG im Schlehert公司，批号166401，规格10mg）、乙腈（上海陆忠工贸有限公司、色谱纯）、磷酸二氢钠、95%乙醇、双氧水，其余试剂均为国产或进口分析纯。

（2）方法

①红茂草生物碱提取工艺

称取红茂草粉末10.0g，选取乙醇体积分数、液料比、浸泡时间、回流作用时间、超声波作用功率、超声波作用温度、超声波作用时间、浸提液pH值、浸提次数、浸提液作用温度等10个单因素水平进行测定。首先固定液料14mL/g、浸泡时间18h、回流作用时间2.5h、超声波作用功率300W、超声波作用温度45℃、超声波作用时间25min、浸提液pH=5、浸提次数1次，减压浓缩时浸提液作用温度40℃，考察乙醇体积分数为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%时对提取效果的影响。然后将优选的最佳乙醇体积分数做为固定数值，依次选取考察液料比为12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1，浸泡时间为0、6h、12h、18h、24h、30h，回流作用时间为1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，超声波作用功率为200W、250W、300W、350W、400W，超声波作用温度25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，超声波作用时间为15min、20min、25min、30min、35min，浸提液pH值为2、3、4、5、6、7、8，浸提次数为1～4次，减压浓缩时浸提液作用温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃时对提取效果的影响。将每次优选后的最佳条件固定，再逐次筛选其余最佳条件，直至结束。

②生物碱溶液的制备

在装有提取物的锥形瓶中加入少许活性炭脱色，静置过夜，抽滤，将滤液按编号装入容量瓶，并定容至50mL，静置。

③样品含量的测定

a.异紫堇碱标准曲线的绘制　准确配制0.5mg/mL异紫堇碱标准品溶液100mL，依次量取1～11mL，分别置于100mL容量瓶中，加无离子水稀释至100mL，摇匀，使之为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL的梯度溶液，以三重蒸馏水为空白，查阅文献，选取OD210值进行测定。以浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

b.样品含量的测定　将25个50mL容量瓶中的提取液稀释后测定其吸光度，对照标准曲线，得出提取液中生物碱的浓度，最后计算出红茂草样品中生物碱提取率。

×100%

④HPLC测定红茂草提取液中生物碱含量

a.色谱条件　Zorbax eclipse XDB C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相V乙腈∶V0.03mol/L磷酸二氢钠=26∶74；流速1.0mL/min；检测波长210nm；柱温（30±1）℃；进样量20μL。

b.HPLC测定时使用的标准溶液配制　准确配制0.1mg/mL的异紫堇碱标准溶液，将其稀释成0.002mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.015mg/mL、0.020mg/mL、0.025mg/mL等不同浓度的溶液，进行HPLC检测。

5.10.2　结果与分析

（1）异紫堇碱标准曲线的绘制

根据异紫堇碱标准品系列浓度梯度在OD210的吸光度，得回归方程：Y=0.0110X+0.0652，R2=0.9998（n=11），其标准曲线如图5-46所示，在5～55μg/mL范围内呈良好的线性关系。

（2）红茂草生物碱单因素提取实验

①乙醇体积分数对提取效果的影响

随着浸提液乙醇体积分数的变化，在65%时生物碱含量最大；随着乙醇体积分数的增大，生物碱含量依次呈明显下降趋势，此时乙醇体积分数对提取效果的影响变得不显著；故选取适宜生物碱提取的乙醇体积分数为65%（图5-47）。

②液料比对提取效果的影响

随着液料比的增加，生物碱的含量也随之增大；当液料比为15∶1时生物碱含量达到最大值；故选取适宜生物碱提取的液料比为15∶1（图5-48）。

随着液料比的增加，生物碱的含量也随之增大；当液料比为15∶1时生物碱含量达到最大值；故选取适宜生物碱提取的液料比为15∶1。

③浸泡时间对提取效果的影响

使用65%乙醇浸泡时间在6～10h时，生物碱含量达到最大峰值；当浸泡时间超过12h后，随着浸泡时间的延长，生物碱含量迅速降低。故选取适宜生物碱提取的浸泡时间为8h（图5-49）。

④回流作用时间对提取效果的影响

使用索氏提取器回流作用时间为2.5h时，生物碱含量呈明显单一峰值，故选取适宜生物碱提取的回流作用时间为2.5h（图5-50）。

⑤超声波作用功率对提取效果的影响

当超声波作用功率为300W时，生物碱含量呈明显单一峰值，故选取适宜生物碱提取的超声波作用功率为300W（图5-51）。

⑥超声波作用温度对提取效果的影响

超声波作用温度在25～55℃时，生物碱含量随温度的升高而增加，并达到最大峰值；当温度超过55℃后，生物碱含量随温度升高而减小。故选取适宜生物碱提取的超声波作用温度为55℃（图5-52）。

⑦超声波作用时间对提取效果的影响

超声波作用时间在15～30min时，生物碱含量随时间的增加而增大，并达到最大峰值；当时间超过30min后，生物碱含量随时间增加而减小。故选取适宜生物碱提取的超声波作用时间为30min（图5-53）。

⑧浸提液pH值对提取效果的影响

当65%乙醇浸提液pH值在2～6时，生物碱含量随pH值的增加而增大，并达到最大峰值；当pH值超过6以后，生物碱含量随pH值增加而减小。故选取适宜生物碱提取的浸提液pH=6（图5-54）。

⑨浸提次数对提取效果的影响

浸提次数为1次时，生物碱含量最大，然后呈明显下降趋势；随着浸提次数的增加，生物碱含量基本趋近于零。表明生物碱浸提次数为1次时效果最佳（图5-55）。

⑩减压浓缩时浸提液作用温度对提取效果的影响

当减压浓缩时浸提液作用温度为20～50℃时，生物碱含量随温度的升高而增加，并达到最大峰值，当温度超过50℃后，生物碱含量随温度升高呈明显减小趋势，故选取适宜生物碱提取的减压浓缩时浸提液作用温度为50℃（图5-56）。

（3）红茂草生物碱正交提取实验

根据单因素实验结果，进行极差分析，最终优选出乙醇体积分数、超声波作用时间、液料比、回流时间、浸提液pH值和浸泡时间，做为影响红茂草中生物碱提取效果的主要考察因素。按照L25（56）正交表进行正交实验，用标准曲线计算出提取液中生物碱含量，用SPSS 17.0软件对其结果进行统计学比较分析，得出最佳正交提取工艺模式，其正交实验结果如表5-41～表5-43所示。

①差异显著（P<0.05）。

对该正交实验结果直观分析表明，影响红茂草中生物碱含量的主次因素和水平分别为C>E>D>A>B>F，优选出的最佳提取工艺为A4B1C3D3E5F1，即乙醇体积分数65%、超声波作用时间20min、液料比15∶1、回流时间2.5h、浸提液pH=8、浸泡时间4h。采用SPSS 17.0统计软件所获数据显著性分析表明，正交实验因素对红茂草生物碱含量的影响，仅C因素（P<0.05）达显著水平，其余F值均小于1，说明这些因素对提取率有影响，但其实验水平的设定仍有调节的空间。

（4）红茂草提取液中生物碱含量测定

HPLC检测波长选定在210nm，采用优化后的正交提取工艺模式，提取红茂草中生物碱，将提取液减压浓缩至无醇味，过滤静置。将异紫堇碱标准品与提取的红茂草生物碱分别进行HPLC检测，其色谱如图5-57、图5-58所示。

可知将异紫堇碱标准品系列的色谱峰面积Y对进样浓度进行线性回归分析，得回归方程为Y=104699X+169.57，R2=0.9997，线性范围为2.0～100.0μg/mL；异紫堇碱标准品保留时间tR的范围为5.410～5.593min。通过正交设计提取的红茂草生物碱样品在5.584min时出峰，峰形对称，与标样接近，经计算其中异紫堇碱含量为9.2794%。

5.10.3　结论

使用正交实验设计，可以减少实验次数，较全面地反映各因素水平对有效成分的提取效果。当乙醇体积分数为65%时，可以降低红茂草中的油脂、糖类等物质的析出，减小生物碱本身的溶解小。改变浸提液的pH，可使红茂草中部分生物碱转化成其相应的生物碱盐，增大其溶解度。浸泡时间过长不但将生物碱溶出，也会将糖类和油脂等溶出，使提取效果下降；长时间浸泡会使生物碱提取周期增大，不利于工艺模式的建立。超声波的振动作用能够使整个生物体及生物细胞壁破裂，加快细胞内物质的溶解，提高扩散速度和提取效率。

本实验通过对一系列影响因素的考察，确定了红茂草中生物碱最佳正交提取工艺模式为A4B1C3D3E5F1，即乙醇体积分数65%、超声波作用时间20min、液料比15∶1、回流时间2.5h、浸提液pH=8、浸泡时间4h。采用SPSS 17.0统计软件对正交结果进行分析，发现液料比对提取率的影响最显著。红茂草生物碱经正交实验优化设计，HPLC法检测，其异紫堇碱含量为9.2794%，表明该法比较合理可靠。通过对红茂草生物碱正交提取工艺模式的建立研究，为红茂草生物碱的提取利用提供了依据，拓展了该植物资源新产品的开发思路，为该药用资源的其进一步研究提供了可能。