4.7 红茂草各组织器官中生物碱保质期的测定
4.7.1 材料与方法
（1）材料
①样品
规范化种植的红茂草，自2008年3月1日到6月1日，根据生长期采样，共计10个批次。根、叶采收后洗净，自然风干，60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过筛，干燥保存、备用。
②仪器与试剂
UV-2450紫外-可见分光光度计（北京瑞利仪器分析有限公司产品）、AB104-S精密电子分析天平（瑞士梅特勤公司产品）。
红茂草生物碱对照品（异紫堇碱）本生物工程实验室制备、保存，20mg/mL。其余试剂均为国产或进口分析纯。
（2）方法
①样品供试液的制备
称取红茂草各器官粉末各5.0g，加400mL 95%的乙醇溶液浸泡1～2d，再经超声波处理1h，过滤，残渣以50mL 95%的乙醇溶液分3次洗涤，合并提取液，用2倍体积的石油醚萃取色素，收集下层生物碱液，蒸馏浓缩至无醇味。加入无水乙醇，沉淀24h，过滤，回收乙醇，趁热加0.5%活性炭脱色，冷却、静置、过夜。用1mol/L NaOH溶液调pH至中性，过滤，加热浓缩至50mL，微孔滤膜（0.22μm）滤过，所得滤液即为实验所需供试液。
②最大吸收光谱波长的选择
将对照品和样品供试液在190～500nm波长范围进行光谱扫描，以确定红茂草生物碱的最大吸收波长。
③标准曲线绘制
精密吸取红茂草对照品供试液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL，置于干燥的试管中，加去离子水梯度稀释至10mL，浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL。以去离子水作空白对照，在210nm波长处测OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
④样品含量的测定
称取不同生长期不同器官的红茂草样品，制成测试品溶液，测其OD值，并计算生物碱含量，进行方差分析。
⑤精密度与稳定性实验
精密度 按样品含量测定项操作，连续测定吸收值6次，记录OD值。
稳定性 按样品含量测定项操作，每隔30d测定1次OD值，观察不同保存期时间内OD值的变化。
4.7.2 结果与分析
（1）测定波长的分析
紫外-可见分光光度计扫描光谱显示，对照品和样品在210nm波长处均有最大吸收值，吸收光谱峰相同（图4-11、图4-12），故本含量测定实验选定210nm作为测定波长。
图4-11 样品根和对照品的紫外吸收光谱
图4-12 样品叶片的紫外吸收光谱
从紫外-可见分光光度计扫描图谱可以看出，根与叶片的吸收光谱相同，最大吸收波长210nm都位于2号波峰，对应生物碱含量最高；1、3号波峰的吸收波长也处于紫外范围，其峰谱面积小，生物碱含量较少。由于对照品为全草生物碱，故吸收峰较根和叶片多。其中，标示的1、2、3号波峰基本一致。
（2）标准曲线的分析
经回归分析得回归方程：Y=53.99384X-0.02640，R=0.9866（n=6）。
实验表明，红茂草生物碱在0.01～0.06mg/mL范围内与吸收度呈良好的线性关系。
（3）精密度与稳定性测定
统计分析6次吸收值（0.121、0.121、0.120、0.121、0.122、0.120），RSD=0.52%（n=6），表明仪器有较好的精密度，实验结果如表4-26所示。
表4-26 稳定性实验测定结果
从以上4批样品测定结果看出，OD值变化很小，样品有效成分在所测2年时间内稳定性良好，可长期保存。
4.7.3 结论
生物碱及其生物碱盐都能溶于甲醇或乙醇，但甲醇毒性很大，而乙醇在生物碱的提取与分离中是最常用的半极性溶剂。红茂草中生物碱主要以游离生物碱和盐类生物碱两种形式存在，游离生物碱大都不溶或难溶于水，能溶或易溶于醇类、甘油等有机溶剂；而盐类生物碱多溶于水，不溶或难溶于有机溶剂。本实验采用95%乙醇和无水乙醇溶液作为提取溶剂，取得了较好的提取效果。超声波产生的振动作用能够使生物细胞壁及整个生物体破裂，加快了细胞内物质的释放、扩散和溶解，同时提高破碎速度和提取率，被浸提的物质在细胞破碎的瞬间，生物活性物质保持不变。在95%乙醇浸泡红茂草干草粉末时，适当使用超声波进行振荡处理，可以提高生物碱的产率。
本实验利用乙醇同时提取生物碱和色素，石油醚进行萃取分离色素，进而纯化了生物碱，避免利用丙酮分离色素。其优点在于：降低了成本，避免回收丙酮所引起的危险，更重要的是不仅提高了生物碱的纯度，减少对人体的危害，而且简化了提纯工艺。
生物碱代谢受组织特异性调控，其常积累足够高的浓度分布在植物最需保护、最易受环境侵害的部位比如嫩叶、芽尖及幼根的外表皮组织，并且遇到环境胁迫和生物侵害时瞬间大量合成。据文献报道，生物碱主要在植物的根、叶片中合成，故本实验采集这两种器官做为实验材料。红茂草不同器官中以叶片生物碱含量最高，根次之，无显著差异，表明生物碱可能主要由叶片合成，通过茎运输到其他器官。这是因为叶片的光合作用或其转化产物是生物碱的底物，叶片光合作用旺盛，产生的底物多，所以合成的生物碱也多，因而叶可能是生物碱的主要产生器官。幼根的生物碱含量也比较高，表明幼根等活性较强的部位也能合成和积累部分生物碱。本研究确定红茂草组织器官中生物碱的保存期限，但仍需进一步的测定和验证。