实验八 凝胶层析法人离血红蛋白与溶菌酶

【原理】

凝胶层析又称凝胶过滤，是根据样品中各种物质分子量的不同，将样品通过凝胶柱来达到分离的目的。

当一混合的蛋白质溶液通过凝胶柱时，分子直径小于凝胶孔隙的可以进入胶粒内部，分子直径大于孔隙的不能进入。因此，小分子蛋白质在前进路上通过胶粒时遭到的阻力大，所以流速慢。相反地，大分子蛋白质不会进入胶粒内部，可以比较顺利地通过胶粒间的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白质分开，因此将凝胶称为“分子筛”。

凝胶颗粒是多孔性的网络结构，其特点为化学性质稳定，不带电荷，与其他物质的吸附力很弱，制成的颗粒机械性能好，不易破碎变形，使液体在层析柱中具有较好的流速。

凝胶过滤的原理可用图2-8-1表示。

两种分子大小不等的蛋白质混合溶液经多孔的凝胶颗粒“1”时，小分子蛋白质进入凝胶颗粒，大分子蛋白质不能进入“2”、“3”，因此大分子的蛋白质先被洗出“4”。

用于凝胶过滤的凝胶，有交联葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺（Bio-Gel）、琼脂糖（Sepharose）等。各种凝胶都是三度空间的网状高聚物，具有一定的孔径和交联度。根据被分离物质的分子大小，形状可选不同类型的凝胶，交联度愈小，则孔径（网眼）愈大，能进入凝胶的分子就愈大，根据交联度的高低，例如Sephadex可分为G10～200，其他凝胶同样可分不同型号，见表2-8-1。

本实验使用Sephadex G-50为层析床，将血红蛋白（红色、分子量64500左右）与溶菌酶（分子量11400左右）从混合液中分开。血红蛋白红色，分子量较大，可观察到较快地洗脱；溶液酶分子量较小，洗脱得较慢，可用双缩脲反应，检查其被洗脱的情况。用蒸馏水为溶剂。

【操作】

（1）凝胶的准备：Sephadex G-50称取2～4g置于锥形瓶中，加蒸馏水30mL，于沸水浴中煮沸1小时（此为加热膨胀，如在室温时膨胀，需放置3小时）取出，待冷致室温时再装柱。

（2）装柱：取直径为0.8～1.5cm，长度为17～20cm的层析柱1支，在柱底部填少许玻璃棉或海绵圆垫，自顶部缓缓加入稀薄的Sephadex G-50悬液，开始下沉时关闭出口，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，凝胶即逐层上升，加至距柱顶3cm左右即可。操作过程中，应防止气泡与分层现象的发生。如表层凝胶凹陷不平时，可用细玻璃棒轻轻搅动表面层，让凝胶自然沉降，使表层平整。

（3）样品制备：①血红蛋白的制备。取草酸钾抗凝血2mL于离心管中，离心5分钟，弃去上层血浆，用0.9%NaCl溶液洗血细胞2次，每次用5mL，要把血细胞搅起，离心后尽量倒去上清液。加水5mL，混匀，放冰箱过夜使充分溶血，再离心10～15分钟（2000r/min），使血球膜残骸沉淀，取上清透明液放冰箱备用。②溶菌酶溶液（150g/L）。③取血红蛋白稀释液0.3mL，加溶菌酶0.3mL，此混合物作为样品。

（4）加样与洗脱：加样时先将出口打开，使层析床面蒸馏水流出，待液面几乎平齐凝胶表层时，关闭出口（不可使凝胶表层干掉）用滴管将样品（约0.8mL）缓缓地沿层析柱内壁小心加于床表面，注意尽量不使床面扰动，然后打开流出口，使样品进入床内，直到床面重新露出，用上法加1～2倍于样品体积的蒸馏水（这样可使样品稀释最小，而样品完全进入床内）。当此少量蒸馏水将近流干时，反复加入多量蒸馏水，进行洗脱，直至两带分开为止。

（5）检查：观察血红蛋白在层析床中色带位置，不断加蒸馏水洗脱。待血红蛋白洗脱完，用试管分别收集洗脱液，每5滴一管，每管加20%NaOH 10滴，0.5%CuSO41滴，（即双缩脲反应），检查溶菌酶的洗脱情况。若为紫色，即为阳性，一般开始几管为阴性，随之为阳性，接着颜色逐渐加深，出现一个顶峰，以后逐渐减弱变为阴性，表示溶菌酶已洗脱完毕。

【试剂】

（1）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）G 50。

（2）草酸钾抗凝血液。

（3）0.9%NaCl溶液。

（4）溶菌酶溶液（0.15g/mL）。

（5）20%NaOH溶液。

（6）0.5%CuSO4溶液。